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上海雅吉生物科技有限公司
主營(yíng)產(chǎn)品： 免疫組化試劑盒，對(duì)照品，抗體，細(xì)胞血清，Elisa試劑盒 |
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主營(yíng)產(chǎn)品： 免疫組化試劑盒，對(duì)照品，抗體，細(xì)胞血清，Elisa試劑盒 |
2016-9-21 閱讀(162)
實(shí)驗(yàn)方法原理 將抗Tac特異性單克隆抗體Ab1吸附于固相載體，識(shí)別細(xì)胞培養(yǎng)上清或血清等標(biāo)本中Tac并與之結(jié)合。應(yīng)用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的識(shí)別另一種Tac表位的特異性單克隆抗體Ab2識(shí)別固定于固相載體的Tac并與之結(jié)合。通過(guò)酶催化底物顯色反映待檢標(biāo)本中游離Tac的水平。
實(shí)驗(yàn)材料 抗體PHA
試劑、試劑盒 緩沖液洗滌液稀釋液終止液
儀器、耗材 塑料板檢測(cè)儀水浴箱冰箱CO2孵箱加樣器
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）
取外周血10 ml，肝素抗凝，常規(guī)分離單個(gè)核細(xì)胞，加至24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，2×106 /孔，RPMI1640-10％ FCS＋PHA 3 μg/ml，Wellcome公司，37 ℃、5 ％CO2培養(yǎng)72 小時(shí)，收集上清，-20 ℃保存待測(cè)。同時(shí)設(shè)未加PHA對(duì)照組?？蛇x用病人血清為待測(cè)標(biāo)本。
2. Ab1包被
用0.05 M pH9.6碳酸鹽包被緩沖液將抗Tac特異性單克隆抗體（Ab1）稀釋至5 μg/ml，加至ELISA板，100 μl/孔，4 ℃包被72 小時(shí)。
3. 封閉
1 ％BSA-PBS封閉，350 μl/孔，37 ℃孵育2小時(shí)。
4. 加樣
ELISA板用PBS-T洗液洗3次，PHA刺激單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清及對(duì)照組上清或病人血清倍比稀釋至1∶1024，每一稀釋度取100 μl加至ELISA板。HUT-102B2細(xì)胞培養(yǎng)上清為陽(yáng)性對(duì)照，RPMI1640-10％FCS培養(yǎng)液為陰性對(duì)照。37 ℃，孵育2 小時(shí)，洗滌。
5. 加酶標(biāo)抗體
于各反應(yīng)孔加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記另一種抗 Tac 特異性單克隆抗體Ab2以效價(jià)滴定的稀釋度稀釋100 μl。37 ℃孵育2小時(shí)，洗滌。
6. 加底物顯色
各反應(yīng)孔加新鮮配制ABTS底物溶液100 μl，37 ℃，孵育15 分鐘。
7. 終止反應(yīng)
各反應(yīng)孔加2 ％氟化鈉終止液50 μl。
8. 結(jié)果判定
首先肉眼觀察反應(yīng)孔內(nèi)顏色，稀釋梯度是否均勻。陽(yáng)性、u性結(jié)果是否明顯。然后于ELISA檢測(cè)儀上測(cè)各孔OD值（410 nm）。
收起
注意事項(xiàng)
1. 包被抗體活性要較高，否則影響本實(shí)驗(yàn)敏感性。
2. 經(jīng)篩選比較，封閉液以1 ％BSA-PBS為好。
3. 酶標(biāo)結(jié)合物應(yīng)用前應(yīng)進(jìn)行效價(jià)滴定，選擇工作濃度。
4. 底物應(yīng)選用靈敏度較高的供氫體如ABTS等。
5. 如有條件，酶標(biāo)McAb可由*-McAb和親和素-HRP系統(tǒng)代替，以增加實(shí)驗(yàn)的敏感性。
