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上海雅吉生物科技有限公司
主營產(chǎn)品： 免疫組化試劑盒，對照品，抗體，細胞血清，Elisa試劑盒 |
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主營產(chǎn)品： 免疫組化試劑盒，對照品，抗體，細胞血清，Elisa試劑盒 |
2016-9-21 閱讀(264)
實驗方法原理 通過特異的抗原抗體反應(yīng)標(biāo)記上可見的顯示物系統(tǒng)來檢查細胞及組織上原位抗原或抗體成分的方法。在光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡或電子顯微鏡下觀察其性質(zhì)定位，還可以利用細胞分光光度計、圖像分析儀、共聚焦顯微鏡等進行細胞原位半定量測定。免疫組織化學(xué)的顯著特點是特異性強。
實驗材料 冷凍切片
試劑、試劑盒 一抗；二抗；三抗（*標(biāo)記的辣根過氧化物酶卵白素）；PBS緩沖液；多聚甲醛；DAB
儀器、耗材 免疫濕盒；滴管；剪刀；進口膜（parafilm）；37度培養(yǎng)箱；移液槍及槍頭；酶標(biāo)筆（PAP）；光學(xué)顯微鏡
實驗步驟
1. 將實驗用試劑從4度冰箱取出，自然平衡至室溫；
2. 將腦片從-20/-80度冰箱中取出，自然平衡至室溫。
3. 用酶標(biāo)筆在腦片周圍畫圈，防止液體在玻片上溢流。
4. 4%多聚甲醛固定30 min。
5. 0.01M PBS洗，5 minX3次。
6. 0.4% Triton-X100/0.01 M PBS 洗10 min X 1次。
7. 0.01M PBS洗，5 min X 3次。
8. 0.3% H2O2/0.01 M PBS 洗10 min X 1次。
9. 0.01M PBS洗，5 min X 3次。
10. 以10%山羊血清（1：10，以0.01M PBS稀釋），37度恒溫箱放置30 min，一般以40 ul/腦片為宜。
11. 傾去封閉血清液，略干，加一抗，4度冰箱放置過夜。
12. 0.01M PBS洗，5 min X 3次。
13. 加二抗（1：200稀釋度），37度恒溫箱放置1h，一般以40 ul/腦片。
14. 0.01M PBS洗，5 min X 3次。
15. 加三抗（1：300稀釋度），37度恒溫箱放置1h，一般以40 ul/腦片。
16. 0.01M PBS洗，5 min X 3次。
17. DAB顯色（DAB配置：1 ml水中，加1滴A液，混勻后，加1滴B液，再1滴C液），顯色約10 min。
收起
注意事項
1. 內(nèi)源性生物活性及其消除*是一種輔酶，是在脫羧基酶、羧基轉(zhuǎn)換酶等催化的代謝環(huán)節(jié)中所產(chǎn)生的羧基中間載體，在應(yīng)用ABC法染色時會與抗*蛋白結(jié)合而產(chǎn)生非特異性染色。對含內(nèi)源性*或*樣物質(zhì)較豐富的組織，在應(yīng)用ABC法前，應(yīng)預(yù)先以0.01％的抗生素蛋白和0.01％*溶液分別作用20分鐘左右，以消除內(nèi)源性*活性。每次作用后應(yīng)用PBS洗5分鐘，更換3次。
此外，zui近已有從鏈霉抗生素蛋白（streptavidin）由于其分子中不含寡糖及等電點接近中性（6－6.5），故非特異性吸附很低。同時鏈霉抗生素蛋白可與長臂*及過氧化物酶結(jié)合成復(fù)合物，此為SABC（streptavidin-Biotin-peroxidase Complex）復(fù)合物，用SABC取代ABC進行標(biāo)記，可提高靈敏度（比ABC高約20倍）及降低非特異性著色。現(xiàn)在SABC已有成品的試劑盒出售。SABC法的操作步驟基本與ABC法相同，只不過要用SABC代替ABC標(biāo)記，即將SABC試劑盒中的A液、B液各取10微升，加入1 ml的PBS中（臨用前配，配好后立即加入切片中）室溫孵育30分鐘。此外*級抗體和第二級抗體的孵育時間均可縮短至30分鐘以內(nèi)，故SABC法是一個快速、簡便、敏感及非特異性著色低的檢測方法。
2. *制劑間相互親和性差異很大，因此在應(yīng)用ABC試劑時，應(yīng)注意廠家和批號，對購進試劑應(yīng)進行事先預(yù)測，以保證實驗結(jié)果的穩(wěn)定性。
3. 標(biāo)記過程中應(yīng)始終保持組織切片的濕潤。
4. 在DAB顯示液中加入鎳等金屬離子，以使反應(yīng)產(chǎn)物呈藍黑色，并用甲基綠復(fù)染核，可加強陽性染色的對比度和提高靈敏度。
5. 在用PBS緩沖液沖洗的過程應(yīng)盡量沖洗*，片子表面不留雜質(zhì)。
6. 準確配比抗體的濃度，因為濃度過高和過低都不利反應(yīng)地進行，在滴加抗體的時候，做到用量少而均勻。
7. DAB是有毒試劑，使用過程中盡量不污染周圍環(huán)境，并且顯色過程中盡量避免DAB見光分解。
8. 滴加每種試劑做到迅速準確，以免片子在反應(yīng)中干燥。
9. ABC試劑保存溫度以4度為佳，據(jù)報告保存達兩年之久，仍能獲得滿意效果，而在-20度，生物活性在短期內(nèi)即被破壞。
